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PCR这么多应用,你知道几个?

可能有的童鞋对PCR不屑一顾,“啥?PCR?不就是Polymerase Chain Reaction,不就是聚合酶链式反应嘛,什么巢氏PCR、Q-PCR,哥都做过,so easy!”,其实PCR也有很多拓展应用,上面的几个只是其中之一而已。

老生常谈,也为了照顾一下可能对PCR只知道皮毛的童鞋,咱们从PCR的祖坟开始刨。

PCR能够在体外进行DNA复制,微量的DNA经过PCR扩增后,DNA片段的量将大幅增加。无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大。这也是“微量证据”的威力之所在。

1)标准的PCR反应体系中应该包含:buffer反应液、DNA聚合酶、镁钾离子、4种脱氧核糖核酸(A、T、C、G)、1对引物、DNA片段模板。

2)反应条件:①加热94℃,DNA模板解链②退火到45~55℃③72℃延伸。

原位PCR( in situ PCR)技术

原位PCR综合了PCR 和原位杂交(Insitu hybridization,ISH) 的优点,是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增,再用特异性的探针原位杂交检测。

细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内,在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织,不易透过细胞膜向外弥散,故保留在原位。

锚定PCR(Anchored PCR,APCR)技术

原理:用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。

应用:它可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

不对称PCR(asymmetric PCR)技术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100:1比例。在起初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

应用:可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

反转录PCR(reverse transcription,RT- PCR)技术

当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT-PCR应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

巢式PCR(NEST PCR)技术

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。

等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR,ASPCR)技术

ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。

这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。

复合PCR(multiplex PCR)技术

原理:在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。

应用:复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术

这个也是大家非常熟悉的方法了,qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平的变化,在癌症、代谢紊乱及自身**性**的诊断和分析中很有价值。

竞争性PCR(competitive PCR,c-PCR)技术

c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA同时扩增,使用同样的引物,但一经扩增后,能从这些目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板,其序列与目的cDNA序列相同,不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点。

这种方法能测定mRNA中cDNA靶序列,可用于几个到10个细胞中mRNA的定量。

 

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