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ELISA 实验失败的常见问题

       结合实验中的实际情况,引起 ELISA 测定结果与文献报导不一致的原因主要有三点,试剂因素、标本因素和操作因素

一、试剂因素

1. 试剂应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便的试剂。

2. 不同厂家的试剂一定不能混用,包括底物和洗涤液。由于校准标准有差异,还有抗体、检测方法、试剂、交叉反应等因素都会导致对样本的检测结果不一致。如:有的厂家酶标板孔间 CV 值大于 20%,标记酶的活性及显色液的稳定性比较差,使用劣质的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。

3. 要注意试剂的批号和出厂日期,虽然试剂的有效期多为 1 年,建议尽量选择刚出厂的试剂盒。

4. 避免选择假的 ELISA 试剂盒。有些厂家为夸大生产 ELISA 的指标范围,用一种指标来冒充其它指标,造成各种种属、各种指标都可以做的假象。

比如用 TGF beta 这样的指标代替大多数试剂盒的其它指标作为检测抗体,同样可以获得良好的标准曲线。因为 TGF beta 在大多数哺乳动物中(human, mouse, rat, pig, bovine, etc.)都有广泛表达,种属间的氨基酸序列同源性达 100%,TGF beta 随着其他因子的影响,其表达水平也会发生相应的变化,使得实验者难以查觉。

       在分析完可能出现的因素后,分享以下鉴别方法,大家可以直接去丁香园搜索「如何鉴别真假 ELISA 试剂盒」。

(1)利用干扰实验可辨别 ELISA 试剂盒是否检测目的抗原。

(2)如果购买了同一公司的 ELISA 试剂盒 A 和 B,利用交叉实验可辨别 ELISA 试剂盒真伪。

(3)指标本身也可以鉴定试剂盒的真伪。

二、标本因素和操作因素

       血清是蕞常用的 ELISA 标本,血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致,分为内源性物质和外源性物质两种:

1. 内源性物质

       有人认为大约 40% 的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体、交叉反应物质和其它物质等。

2. 外源性物质

       外源性物质常常是由于用于 ELISA 测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。

三、总结

       当 ELISA 测定结果与预期或文献报导中不一致时,应该首先考虑试剂因素,这个是做好实验获得正确数据的前提保证,其次还有标本因素和操作因素等多方面进行分析,并应采取相应措施排除干扰作用,从而为实验提供正确可靠的检测结果。

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