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详细内容

原代细胞培养问题你该如何解决?

错误1:

一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间。

纠正1:

原代细胞对解冻过程非常敏感,因此将小瓶置于37℃水浴中,保持并轻轻旋转直到内容物刚刚解冻是很重要的。然后应立即从水浴中取出小瓶,并转移到无菌操作台。确保您的培养瓶在解冻前已经准备就绪,以便可以立即用于接种细胞,并置于培养箱中。

 

错误2:

解冻match小瓶后直接离心原代细胞。

纠正2:

我们不建议在解冻后离心细胞,因为离心程序比少量的DMSO残留更有害。记住,在恢复原代细胞后的第二天更换培养基以去除任何残留的DMSO。

 

错误3:

允许原代细胞变得过于融合。

纠正3:

当生长至100%汇合时,原代细胞可以变得衰老。记住,原代细胞不是100%纯,因此重要的是尽量减少污染细胞的生长。我们建议在细胞达到90-95%融合时,对原代细胞进行传代培养。

 

错误4:

传代原代细胞时过度胰蛋白酶消化。

纠正4:

当细胞传代时,使用低浓度的胰蛋白酶并在显微镜下密切监测细胞。此外,记得在胰蛋白酶消化后完全中和细胞中的胰酶,因为任何活性的胰蛋白酶都将损伤细胞。

 

错误5:

原代细胞可以很容易地重新冻存。

纠正5:

通常我们不推荐重新冻存原代细胞,因为这可以促进细胞衰老和/或导致功能变化。原代细胞非常敏感,重新冻结可能导致细胞死亡或损伤。

 

错误6:

原代细胞可以无限的增殖。

纠正6:

与细胞系不同,原代细胞具有有限的扩增能力。我们建议尽早使用原代细胞进行实验以防止遗传漂移。此外,如果你正在使用一个增值困难的细胞类型,你应该密切监测细胞形态,因为少量混杂的细胞(如成纤维细胞)可能随着时间的推移,大量生长从而成为主要细胞。


错误纠正后就该步入正轨啦——

 

应如何进行冻存细胞的培养?

下列步骤以单管冻存细胞进行培养的实验方案为例。

● 准备一烧杯37°C的水。

● 从液氮储存中取出一管细胞,注意保护手和眼睛。

● 拧松管盖1/4圈,等待10秒钟以释放螺纹中可能残留的液氮,再重新拧紧管盖。

● 将冻存管的下半部分置于37°C水浴中进行解冻,直至冻存管内仅剩余一小块冰芯,使细胞迅速解冻。

● 用disinfectant擦拭管体外表面,再将其移至II级A型层流细胞培养通风橱中。

● 打开管盖,使用1 mL移液器上下吹打细胞悬液以分散细胞。

● 从管中吸取20 uL细胞悬液,并将其稀释于20 uL台盼蓝溶液中。

● 使用血细胞计数板来确定每毫升悬液中的活细胞数。

● 将管中悬液(1 mL)稀释至产品说明中的推荐浓度。

● 将5 mL细胞悬液加入25 cm2培养瓶,或将15 mL细胞悬浮液加入75cm2培养瓶中。

● 摇匀培养瓶中的培养基以彻底分散细胞。许多类型的细胞都会迅速贴壁,如果没有在传代后即刻摇匀细胞,细胞可能生长不均匀。

● 在37°C、5% CO2/95%空气、湿度细胞培养箱中培养细胞。为了获得好的结果,培养开始后至少在24小时之内不要扰动细胞。

 

是否可以对扩增后的细胞重新冻存?如果可以该如何操作?

当从细胞库购买的冻存或正处于增殖期的细胞,可对其进行扩增和重新冻存。不过,冻存操作可能会对细胞的生长状态有所影响。下列实验方案为大家提供了一份使用无蛋白成份的冻存培养基冻存细胞的基础指南。

 

请注意:由于冻存设备与个人技术之间的差异,我们无法确保使用本方案冻存的细胞在复苏后能够保持活力,我们也无法为研究用户实验室冻存细胞的效果进行担保。

 

● 使用37°C水浴化冻无蛋白成份的冻存培养基或4°C条件下过夜化冻。

● 如果在水浴中进行化冻,请确保温度不要超过37°C,也勿将该产品延长时间置于37°C。

● 无蛋白成份的冻存培养基在使用前应置于4°C条件下彻底平衡。为获得好的结果,推荐大家使用能够控制变温速率的冰箱。如果缺少能够控制变温速率的冰箱,也可使用细胞冻存盒。

● 如需用酶试剂解离培养器皿表面的细胞,则需使用对应的终止溶液重悬细胞以中和酶的效果。

● 通过离心沉淀细胞。

● 去除上清液后,使用预冷的无蛋白成份的冻存培养基以5x10E5至3x10E6细胞/毫升的密度重悬细胞。

● 将细胞悬液分装至合适数量的冻存管中。

● 将细胞尽快冷却至4°C。

● 如果使用控制变温速率的冰箱:以每分钟降低1°C的速率冰冻样品,直至–40°C。之后按照每分钟降低2°C的速率降至–90°C左右。

● 如果使用细胞冻存盒:请按照说明书来准备冻存盒。

● 为获得好的结果,推荐大家在细胞温度降至–80°C后,尽快将冻存管转移至液氮储存设备的气相中。

● 作为无蛋白成份的冻存培养基的替代品,可使用该冻存细胞推荐的基础培养基,添加10%胎牛血清(FBS)和10% DMSO进行细胞冻存。

 

 

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