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详细内容

质粒提取

一、基本原理及实验目的

    质粒提取实验的目的是获得较纯净的DNA质粒。常用的方法有碱裂解法和煮沸法,其中碱裂解法是蕞常用的小量制备质粒DNA的方法。

二、主要仪器及试剂

    高速离心机,质粒提取试剂盒(Bioflux)。

三、操作步骤(以Bioflux公司的试剂盒为例)

1、将1ml过夜培养的菌液倒入离心管中,室温12000r/min,离心1min。

2、弃培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。

3、加入预冷的I液250ul,涡旋振荡使细胞完全重新悬浮。

4、往悬浮液中加入II液250ul,盖紧管口,温和上下颠倒4-6次,获得澄清的裂解液。

5、往上述混合液中加入III液350ul,盖紧管口,温和上下颠倒4-6次,直至形成白色絮状沉淀。室温13000r/min,离心15-20min。

6、小心吸取上清液,确保没有沉淀吸出,转移至收集柱中。室温12000r/min,离心1min。

7、弃去离心甩出液,加入700ulDNA洗涤缓冲液洗涤柱子,室温12000r/min,离心1min。

8、重复操作步骤7,弃去甩出液。

9、空离心,室温12000r/min,离心1min。

10、把柱子置于一个干净的1.5ml离心管中,加入TE缓冲液50-100ul到柱子上,静置2min。

11、室温12000r/min,离心1min,以洗脱出DNA。可选重复操作进行第二次洗脱。

12、提取的质粒可于4℃短期保存,并可于-70℃或-20℃长期保存。

四、结果判读

    质粒本质是双链DNA,其质量和纯度可以用紫外分光光度计定量,高质量的质粒定量结果OD260/OD280在1.8左右,越接近1.8越好,若比值明显低于1.8可能存在蛋白或提取试剂污染,明显高于1.8可能存在RNA污染,OD260值在0.1-1.0之间,OD260/OD280的读数才可信。质粒浓度=OD260值×50×稀释倍数/1000。

五、注意事项

1、过夜培养后,收集的细菌量一定要足够,以保证提取质粒的浓度。

2、加入I液后,涡旋振荡一定要充分,以保证细菌完全裂解。

3、吸取上清液保证没有沉淀,宁可少吸取一些液体。

4、空离心十分必要不能忽略。


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