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WB免疫印迹实验步骤及需要注意什么?

    免疫印迹(immunblotting)又称蛋白质印迹(western blot),他是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹(western blot)具有
SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现在已成为蛋白分选的一种常规技术。免疫印迹(western blot)常用

于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分选。

western blot一般实验步骤:蛋白质抽提,蛋白质定量,变性聚丙稀酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE),蛋白质转移,western blot膜的封闭和抗体孵育,western blot结果检测,western blot数据分析,提供实验报告。

免疫印迹实验步骤及需要注意事项:     

1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。


2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr。


3、弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。


4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。


5、弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次。


6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。


7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。


8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

需要注意事项:


     1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定蕞佳条件。

     2.上样顺序必须搞清楚,在一张膜上才能比较,分组太多的话,可以每样选择一个样本即可。

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